共聚焦顯微鏡與普通光學顯微鏡的比較

　　顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據光源不同，可分為(wei) 光學顯微鏡和電子顯微鏡兩(liang) 大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為(wei) 光源，後者則以電子束為(wei) 光源。普通光學顯微鏡與(yu) 激光共聚焦顯微鏡同屬於(yu) 光學顯微鏡。
　　一、普通光學顯微鏡
　　普通生物顯微鏡由3部分構成，即：①照明係統，包括光源和聚光器；②光學放大係統，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體(ti) ，為(wei) 了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由複雜的透鏡組構成；③機械裝置，用於(yu) 固定材料和觀察方便。
　　顯微鏡物象是否清楚不僅(jin) 決(jue) 定於(yu) 放大倍數，還與(yu) 顯微鏡的分辨力（resolution）有關(guan) ，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標25cm處）能分辨物體(ti) zui小間隔的能力，分辨力的大小決(jue) 定於(yu) 光的波長和鏡口率以及介質的折射率，用公式表示為(wei) ：
　　R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2
　　式中：n=介質折射率；α=鏡口角（標本對物鏡鏡口的張角），N.A.=鏡口率（numeric aperture）。鏡口角總是要小於(yu) 180?，所以sina/2的zui大值必然小於(yu) 1。
　　製作光學鏡頭所用的玻璃折射率為(wei) 1.65~1.78，所用介質的折射率越接近玻璃的越好。對於(yu) 幹燥物鏡來說，介質為(wei) 空氣，鏡口率一般為(wei) 0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為(wei) 介質，鏡口率可接近1.5。
　　普通光線的波長為(wei) 400~700nm，因此顯微鏡分辨力數值不會(hui) 小於(yu) 0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設計的zui大放大倍數通常為(wei) 1000X。
　　二、激光共聚焦掃描顯微境
　　激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope），用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐麵快速掃描成像，掃描的激光與(yu) 熒光收集共用一個(ge) 物鏡，物鏡掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。由於(yu) 激光束的波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學顯微鏡的3倍。係統經一次調焦，掃描限製在樣品的一個(ge) 平麵內(nei) 。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chu) 於(yu) 計算機內(nei) ，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體(ti) 結構。
　　為(wei) 什麽(me) 需要共聚焦顯微鏡?
　　1.光學顯微鏡經過了我們(men) 偉(wei) 大的前人們(men) 的努力與(yu) 改良，已經臻於(yu) 完善的地步。事實上，通常的顯微鏡可以簡單、快捷地為(wei) 我們(men) 提供美麗(li) 的微觀圖像。但是，給這個(ge) 近乎完善的顯微鏡世界帶來革命性創新的事件發生了，這就是“激光掃描型共聚焦顯微鏡”的發明。這種新型顯微鏡的特點是：采用僅(jin) 將焦點所集中的麵上的圖像情報提取出來的光學係統，通過改變焦點的同時將所獲得的信息在圖像存儲(chu) 器內(nei) 複原，從(cong) 而可以獲得具有*3維信息情報的鮮明的圖像。通過這個(ge) 方法，可以簡單地獲得以通常的顯微鏡所無法確認的、關(guan) 於(yu) 表麵形狀的信息。另外，對於(yu) 通常的光學顯微鏡來說，“提高分辨率”與(yu) “加深焦點深度”是相互矛盾的條件，尤其在高倍率時這個(ge) 矛盾更為(wei) 突出，但在共聚焦顯微鏡來講，這個(ge) 難題迎刃而解。
　　2.共聚焦光學係統的優(you) 勢
　　激光共焦顯微鏡原理圖
　　共聚焦光學係統是對樣品進行點照明，同時反射光也采用點感受器來受光。樣品被放置在焦點位置時，反射光幾乎全部可以到達感光器，樣品偏離焦點時，反射光無法到達感光器。也就是說，共聚焦光學係統中，隻有與(yu) 焦點重合的圖象會(hui) 被輸出，光斑、無用的散亂(luan) 光都被屏蔽掉了。
　　3.為(wei) 何用激光？
　　共聚焦光學係統中，對樣品進行點照明、同時反射光亦采用點感光器受光。因此，點光源就成為(wei) 必要。激光屬於(yu) 非常的點光源。大多數情況下，共聚焦顯微鏡的光源都采用激光光源。另外，激光所具有的單色性、方向性以及優(you) 異的光束形狀等特征，也是被廣泛采用的重要理由。
　　4.高速掃描基礎上的實時觀察成為(wei) 可能
　　激光的掃描，其水平方向采用了聲控光學偏向單元（Acoustic Optical Deflector，AO素子）、垂直方向采用了伺服電控光束掃描鏡（Servo Galvano-mirror）。音響光學偏向單元由於(yu) 不存在機械性震動部分，所以可以進行高速的掃描， 在監視畫麵上實時觀察成為(wei) 可能。這種攝像的高速性，是直接影響聚焦、位置檢索速度的非常重要的項目。
　　5.焦點位置和亮度的關(guan) 係
　　共聚焦光學係統中，樣品被正確地放置在焦點位置時亮度為(wei) zui大，在它的前後，其亮度皆會(hui) 銳減（圖4實線）。這種焦點麵的敏感的選擇性，也正是共聚焦顯微鏡高度方向測定以及焦點深度擴張的原理所在。相對於(yu) 此，通常的光學顯微鏡則在焦點位置前後不會(hui) 有明顯的亮度變化（圖4點線）。
　　6.高對比度、高分辨率
　　通常的光學顯微鏡，由於(yu) 偏離焦點部分的反射光會(hui) 發生幹擾，它與(yu) 焦點成像部分發生重疊，從(cong) 而造成圖像對比度的降低。而相對於(yu) 此，共聚焦光學係統中，焦點以外的散亂(luan) 光以及物鏡內(nei) 部的散亂(luan) 光幾乎*被去除掉，因而可以獲得對比度非常高的圖像。另外，由於(yu) 光線2次通過物鏡使得點像更加先銳化，也提高了顯微鏡的分辨能力。
　　7.光學局部化功能
　　共聚焦光學係統中，與(yu) 焦點重合點以外的部分的反射光被微孔屏蔽掉了。因此在觀察立體(ti) 樣品時，形成如同用焦點麵對樣品進行切片後形成的圖象（圖5）。這種效果被稱為(wei) 光學局部化，屬於(yu) 共聚焦光學係統的特長之一。
　　8.焦點移動記憶機能
　　所謂焦點以外的反射光被微孔屏蔽掉，反過來看的話，可以認為(wei) 共聚焦光學係統所成的像上所有的點均與(yu) 焦點重合。因此將立體(ti) 樣品沿Z軸（光軸）方向移動的話，將圖像累積保存在存儲(chu) 器內(nei) ，zui終就會(hui) 獲得樣品全體(ti) 與(yu) 焦點重合而形成的圖像。以這種方法將焦點深度無限加深的機能稱做移動記憶機能。
　　9.表麵形狀測定機能
　　焦點移動機能上，追加以麵的高度記錄回路，就可以對樣品的表麵形狀進行非接觸式測定。以此機能為(wei) 基礎，對各畫素中zui大輝度值形成的Z軸坐標的記錄成為(wei) 可能，並以此情報為(wei) 依據可以獲得樣品表麵形狀相關(guan) 的情報。
　　10.高精度微小尺寸測定機能
　　受光單元采用了1維CCD成像傳(chuan) 感器，因此可以不受掃描裝置掃描傾(qing) 斜等的影響，從(cong) 而可以完成高精度的測定。另外，由於(yu) 同時采用焦點深度可調（加深）的焦點移動記憶機能，從(cong) 而可以剔除由於(yu) 焦點偏移而造成的測定誤差。
　　11.三維圖像解析
　　使用表麵形狀測定機能，可以輕鬆地做出樣品表麵三維圖像。不僅(jin) 如此，還可以進行多種解析如：表麵粗糙度測定、麵積、體(ti) 積、表麵積、圓形度、半徑、zui大長度、周長、重心、斷層圖像、FFT變換、線幅測定等等。
　　激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用於(yu) 觀察細胞形態，也可以用於(yu) 細胞內(nei) 生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量。